화학 분석의 일반적 단계(초콜릿에 포함된 카페인 정량) #1

화학 분석의 일반적 단계는 아래 일곱가지로 정리할 수 있다!

1. 질문 구성
2. 분석 과정 선택하기 3. 시료 채취
4. 시료 준비
5. 분석
6. 보고와 해석
7. 결론 도출

일반적 7가지 단계는 중간 고사에 나올 만큼 중요한 사항이다.
(초콜릿 속 카페인과 테오브로민을 분석하는 단계를 보여줄 것이다. )
EX. 초콜릿 생산 업체에 소비자가 컴플레인을 했습니다.
초콜릿을 먹었더니 잠이 안 오던데 한계양보다 한참 많이 들어간 게 아니냐 ?
컴플레인이 들어오면 초콜릿 생산업체는 카페인과 테오브로민이 얼마나 들어 있는지 분석에 들어갑니다.
분석 과정을 걸쳐 결과가 법적으로 허용하는 한계 값보다 많이 나오면 그 결과를 가지고 초콜릿을 만드는 과정에서 카페인이나 테오브로민이 더 많이 들어가서 문제가 되었으니 어느 절차가 문제였는지 조사하고 개선하게 되는 과정을 갖습니다.
이런 걸 통해서 초콜릿의 품질을 관리하게 되는 일반적인 절차가 되겠습니다.

1. 질문 구성
이 분석 결과가 어디에 쓰일 것인가에 대한 질문이 될 것이고, 그런 질문이 구성이 되면 그 물질 분석에 있어 가장 적합한 분석 법을 선택하고 시료가 다양한 상태이기 때문 분석에 알맞은 시료를 채취하고 준비하는 과정이 지나 본격적으로 분석하며, 분석 후 데이터를 통계처리해서 결론적으로 어떤 숫자가 나오고, 그 숫자를 보고하고 해석하고 목적을 위해 사용하는 결론 도출 과정이 이어집니다.
초콜릿 속 카페인과 테오브로민을 분석하는 단계를 보여줄 것이다. 제대로 된 질문이 되지 않으면 제대로 된 결과를 얻을 수 없다.

2. 분석 과정 선택하기
분석 과정을 선택하면 그 분석에 필요한 장비나 시약들이 정해진다. 시약이나 장비가 없으면 제약되므로 고려된다. 아무리 찾아도 분석 법이 없으면 분석 과정을 만들어서 한다. 그러나 문제들이 많이 발생할 수 있으므로 전문적인 지식이나 노하우가 없으면 독창적인 실험 과정은 불가능할 경우도 있다.

3. 시료 채취
때에 따라서 시료 채취가 필요 없을 수 있지만 초콜릿에서는 필요한 과정이다. 특히나 초콜릿 중에서 쿠키, 알코올 등 다른 성분이 섞여있는 초콜릿은 시료채취 과정이 중요하다. 초콜릿도 겉으로 보기에는 균일해 보이지만... 아니다. 일반적으로 고체 시료를 채취할 때는 불균일하다 생각하고 균일화시켜주면 좋다.

4. 시료 준비
대표시료를 녹여 화학 분석에 적합한 시료로 바꾸는 과정이다. 잘 갈아진 초콜릿(대표 시료)를 일부 채취한다. 고체 상태이기 때문에 액체 상태로 바꾼다.
( 대부분 화학분석에서 고체 상태에서 바로 하는 경우는 별로 없고 용매에 녹여 용액 상태로 바꿔서 사용 가능하다.) 농도가 낮을 시 농축도 하고, 분석을 방해하는 화학종을 제거한다. 크로마토그래피에서 지방은 손상 시킬 수 있으니 반드시 제거한다. 다양한 시료 준비 방법이 있는데, 시료 준비하는 사람이 오랜 시행착오를 겪고 노하우들이 생겨 만든 것들이고 크로마토그래피에서는 대표적으로 고체상 추출 법이 있습니다. 고체상에서 원하는 물질을 추출해서 크로마토그래피 칼럼에 주입하는 방법이 개발되어 있습니다.

앞에서 잘게 부순 초콜릿을 적당한 용매에 녹이고 흔든다. 흔들면 현탁액처럼 뿌연 용액이 만들어지고 이걸 원심 분리기에 돌린다. ( 원심분리기는 물질의 무게에 따라 분리시켜주며 무거운 것은 가라앉고 가벼운 것은 위로 뜬다. 맑은 용액 경우는 분석 물질이 들어있지 않다고 간주하여 버리고 바닥에 쌓인 잔류물만 다음 단계로 넘깁니다.)

잔류물을 끓는 물에 넣어 잘 흔든 다음 일부를 취해서 다시 원심분리를 합니다.
상층액을 뽑아 필터가 달린 실린지를 이용해서 덩어리가 큰 것들을 걸러주는 작업을 한다.
(덩어리가 큰 것을 사용하면 안 되는 것도 크로마토그래피에 손상을 줄 수 있기 때문에 작은 입자를 사용한다.)

크로마토그래피에 대한 간단한 원리에 대해 설명하는데,
a) 크로마토그래피에 먼저 용매를 투입하고
b) 분석하는 물질을 넣습니다. 세 가지 혼합물을 넣었을 때 용매를 이용해서 분석물을 흘려주면
c) 크로마토그래피와 상호작용이 낮은 것은 먼저 나오고
d) 상호작용이 높은 것은 천천히 나오게 된다. 나오는 부분에 검출기를 갖다 대고 이 물질에 양을 알아내는 방식이 크로마토그래피 방식입니다.
즉, 물질을 분리시킨 후 정량을 할 수 있는 원리이다.

5. 분석
시료 준비가 끝나면 본격적인 분석이 이루어지며 장비는 크로마토그래피를 이용하고 시료를 크로마토그래피 칼럼에 주사기를 통해 주입한다. 분석은 반복 측정을 해야 하며 동일한 몇 개의 분취량으로 나누어 각각의 분취에 대해 측정을 여러 번 한다. 평균을 내고 표준 편차를 구하는 과정에서 유추할 수 있듯, 결과에 불확정도를 평가하고 시료 한 개만 측정할 때 발생할 수 있는 큰 오차를 막기 위함이다. 측정의 불확정도는 내가 측정한 결과값이 얼마나 참값과 표준값과 다를 수 있나! 쉽게 말하면 얼마나 오차를 가질 수 있는지 숫자로 나타내는 것입니다. 불확정도는 자세히 배울 것으로 중요하다. 항상 오차가 있기 때문 그 오차를 불확정도로 말해줘서 보다 내 측정이 과학적인, 합당한 과정을 통해 이루어졌다는 것을 보여준다. 평균이 있고 표준편차가 있으며. 표준편차만큼 벗어날 수 있다는 것을 보여준다.

크로마토그래피의 분석 고정을 도식화하여 그림으로 보이는 것이다. 크로마토크래피는에서 SiO2는 칼럼을 채우는 고정되어 있는 물질에 해당되고 주입한 물질이 고정된 물질 SiO2표면에 작용기들과 상호작용하여 상호작용이 낮은 것들을 빨리 나가고 상호작용이 큰 경우 천천히 나온다. 빠져나온 순서대로 적외선램프가 있는 검출기를 통과하고, 물질들 중에서 적외선을 흡수하는 것들을 여기서 검출이 됩니다. 적외선을 흡수하지 않으면 검출 안 된다. 검출기도 원리가 여러 가지 있는데 주로 물질 간의 상호작용할 수 있는 것들이 활용되며 여기서 카페인이 적외선을 흡수하기 때문에 검출기로 활용될 수 있다. 카페인과 테오브로민에 대해 분석하는 것이니까, 두 개가 섞인 용액을 주입하고 용매를 이용해 흘려보내면 고정상에 있는 공간을 내려가면서 두 물질이 표면에 있는 작용기와 상호작용 차이에 의해 분리가 된다. 카페인이 느리게 이동하고 테오브로민이 빠르게 이동하는 것을 볼 수 있다. 카페인은 고정되어 있는 SiO2 작용기와 상호작용이 테오브로민보다 더 크다. 시간이 길어지면 이 차이는 더 벌어진다.

크로마토그래피 검출기에서 나오는 신호는 시간에 따른 흡수된 양으로, 흡광도라 하며 시간에 따른 흡광도로 주어진다. 먼저 나온 테오브로민이 이른 시간대, 카페인이 늦은 시간대에 보인다.피크 면적은 물질의 양과 관련되어 있다. 그러나 물질마다 감응하는 정도가 다르기 때문에 절대적으로 피크 면적으로 많고적음을 비교할 수 없다.

앞에서 시간에 따른 흡광도 변호를 크로마토그래피 통해서 얻고 그것을 통해 미지물질의 양을 정량합니다. 앞에서 얻은 피크 크기를 그대로 이용해서 카페인의 양을 얻을 수 없다. 그 부분이 어려우며 교정곡선을 통해서 미지물질의 양을 알아내야 합니다. 교정곡선은 농도를 알고 있는 순수한 카페인의 표준용액을 이용해서 칼럼에 주입하여 피크의 높이를 측정한다. 여러 농도의 표준 용액을 만들고 각각의 흡광도의 크기를 도시하여 표준 곡선 또는 교정곡선이 얻어지며 그 곡선을 통해 미지 물질의 양을 역으로 간접적으로 계산 또는 산출해내는 방법이다.

위 사진은 표준물질을 이용해서 만들어낸 표준곡선입니다. 미지시료 속 테오브로민과 카페인이 있을 거라 생각하면 두 시료의 표준용액을 준비하여 몇 가지 농도를 만들어줍니다. 사진에서는 4개의 농도를 만들어 각각에 농도에 대해 크로마토그래피를 이용해 흡광도 크기를 조사했습니다.(피크 크기) 각각의 4개의 점과 가까운 직선을 통계적인 방법을 통해 그려준 게 표준곡선이다. 미지 시료를 다시 크로마토그래피를 통해 측정된 피크 값(y 축)을 이용해서 물질 농도(x축)의 값을 얻을 수 있다. 여러 개의 분취를 이용하면 여러 개의 피크와 농도 값이 나올 것이고 그것을 평균 내고 표준편차를 계산 및 통계적 작업을 한다. 분석하고자 하는 물질이 있을 때 그 물질에 대한 표준물질이 반드시 있어야 합니다. 없으면 정량하지 못한다.
정리: 표준용액으로 표준곡선을 그리고 미지시료의 피크 값을 표준곡선에 대입하여 농도를 알아낸다.

6. 보고와 해석
결과와 함께 표준편차와 평균을 내고 다른 통계적 방법으로 불확정도를 정하고 보고를 하게 됩니다.
그 값에 대한 한계점을 같이 첨부한다. 불확정도가 한계를 나타내는 일부이다.
보고서가 활용하기 쉽게 작성되어야 한다.

7. 결론 도출
분석자가 보고하면 의뢰자는 보고자료로 결론을 도출합니다.
기타 실험 과목 절차와 좀 다르다. 실험도 하고 보고서도 쓰고 결론도 쓰고~
실제로 기업에서 분석 의뢰할 시 분석업체는 결과만 의뢰 기업에 보고하고 결론도출은 의뢰한 기업이다. 예를 들면 초콜릿 속 카페인 양이 기준치 보다 많다는 보고서를 보면 공장에서 원료물질이나 공정을 바꾸는 과정이 결론도출이다.
분석한 사람이 결론도출에 참여하면 이 사람의 의도가 결론도출에 포함되는 것이다. 중요한 선택을 할 때 의도와 달리 분석자 의도 때문에 문제가 생길 수도 있어서 결론도출 주체와 분석자와 분리되어 있다.